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Vibrio cholerae : bacteria ambiental con diferentes tipos de vida

 

Carlos A. Eslava, Irma Rosas, Martha Solano, Gabriela Delgado, Maritoña Ramírez, Jorge M. Villaseca y Alejandro Cravioto.

 

1. Introducción

En 1965 Véron propuso crear la familia Vibrionaceae, en dicha propuesta consideró agrupar aquellos géneros cuyas especies fueran oxidasa positiva y móviles por un flagelo polar. La familia está constituida por los géneros Vibrio, Photobacterium, Aeromonas y Plesiomonas. El género Vibrio incluye 35 especies de las cuales 26 se han identificado como agentes etiológicos de enfermedad en humanos, de éstos Vibrio cholerae es una de las especies con mayor importancia clínica y epidemiológica (1).

Los vibrios son proteobacterias-gama, heterótrofas, cuyo hábitat primario son los ecosistemas acuáticos salobres y marinos, en donde ocupan una gran diversidad de nichos. Están presentes en la columna de agua y en el sedimento, por lo que se les puede encontrar como bacterias de vida libre, comensales, saprobias o parásitas (2). Las bacterias de este género son bacilos curvos o rectos, Gram negativos, anaerobios facultativos, móviles por flagelos polares y no esporulados. Para estimular el crecimiento de Vibrio spp. se requiere de 5 a 15 mM de NaCl. Sin embargo, V. cholerae puede crecer sin la adición de NaCl al medio y a un pH alcalino (10-6.0), menor de 6.0 el crecimiento es inhibido (3).

 

2. Comportamiento de Vibrio en estado de vida libre

Cuando los vibrios se encuentran en su forma de estado libre (planctónica) nos queda claro que las condiciones en este hábitat son extremas, ya que el material suspendido en la columna de agua, así como el contenido de nutrimentos en general es bajo(4). En tal situación adopta una condición morfológica diferente a la que conocemos, disminuye su tamaño (pueden pasar filtros de hasta 0.2 ?m) por lo que en este estado se denominan microvibrios (5).

Diversos estudios señalan que los vibrios tienen preferencia por los ecosistemas acuáticos como epibionte, asociado tanto a sustratos vivos como abióticos. Su asociación con material suspendido les asegura que en algún momento pueden ser depositados en el sedimento donde encontrarán mayor concentración de nutrimentos, por otro lado también se pueden mover hacia niveles superiores a través de la cadena alimentaria iniciando su viaje con organismos bentónicos filtradores y detritívoros (6). Se sabe que los vibrios pueden adherirse a diversos organismos acuáticos, V. cholera, por ejemplo, se asocia con copépodos del plancton, otros del zooplancton, raíces de lirio acuático, algas etc. (7). También se ha observado que la bacteria sobrevive y crece en dos especies de amibas de agua dulce.

 

Figura1. Mecanismos de supervivencia de Vibrio cholera en zonas estuarinas.

 

La adherencia de los vibrios a los sustratos bióticos se considera como una interacción de tipo comensal, en este caso las bacterias utilizan compuestos de excreción como las llamadas proteínas de adhesión asociadas a la superficie. Durante este proceso es importante considerar propiedades como la producción de enzimas como la quinolasa que le confiere a la bacteria la capacidad para actuar como degradador de la quitina (8,9). Este polímero es muy abundante en los sistemas salobres y marinos, ya que forma parte del exoesqueleto de crustáceos como la jaiba y el camarón, por lo que representa una fuente muy rica de carbono y nitrógeno.

 

3. Vibrio microorganismo patógeno en su hábitat

Es importante analizar los casos en que los vibrios pueden actuar como patógenos de organismos acuáticos de importancia comercial, o bien que estos organismos puedan ser un vector de patógenos para el hombre. Al respecto se ha estudiado la relación entre Vibrio y los copépodos, por un lado la bacteria utiliza la quitina de estos últimos como sustrato y por otro, dado que uno de los sitios de colonización es el saco ovígero, cuando el copépodo libera los huevos fertilizados al ambiente estos se constituyen en un vehículo para la diseminación de los vibrios (7).

Con respecto a su participación como patógeno, se ha reportado que V. anguillarum, V. alginoliticus y V. splendidus son responsables de ocasionar la muerte de larvas de ostión. Se ha estudiado el posible mecanismo por el cual colonizan y producen la muerte de dichas larvas, los resultados señalan que un estado de estrés del hospedero da lugar a una respuesta neuroendócrina que incrementa los niveles de noradrenalina induciendo la liberación de hierro, elemento importante para la reproducción de los vibrios (10). Se ha establecido que ciertos factores ambientales afectan el comportamiento de la bacteria, diversos estudios muestran como el incremento de la temperatura influye en el comportamiento patógeno de diferentes especies de Vibrio sobre ciertos organismos acuáticos (11).

 

V. coralliilyticus : Pocillopora damicornis
V. splendidus : larvas Crassostrea gigas
V. carcharine : Haliotus tuberculata
V. vullneficus: Angulla anguilla
V. peneaicida : camaron
V. parahaemolyticus: peces

 

4. Transmisión de Vibrio al humano

Los organismos acuáticos, principalmente los bentónicos filtradores que se consumen crudos, pueden ser vectores de vibrios patógenos para el hombre. En las costas del Golfo de México V. vulnificus alcanza concentraciones de hasta 105 UFC g-1 de ostión, con temperaturas >20 ?C y salinidades de 5 a 20 %. En el Pacífico noroeste de Estados Unidos al registrase un incremento de temperatura entre 1-5 ?C asociados a “El Niño” se produjeron altos niveles de V. parahaemolyticus en ostión (11000 UFC g-1), un evento similar se reportó para la bahía de Galveston, Texas (12).

 

Figura 2. Comportamiento biológico de Vibrio, mecanismos de transmisión al humano y al ambiente acuático.

 

5. Vibrio cholerae bacteria con habitat primario acuático, patógeno de humanos

En 1935 Gardner y Venkatraman hicieron la primera clasificación de Vibrio cholerae basándose en las características del antígeno somático (O), asignándose el serogrupo O1 al agente causal del cólera. V. cholerae también expresa un antígeno flagelar (antígeno H), el cual es igual en todos los miembros de la especie. Dentro del serogrupo O1, existen tres variedades antigénicas o serotipos (basados en las diferencias de los componentes del polisacárido del antígeno somático) designadas como Ogawa, Inaba e Hikojima según su formula antigénica AB, AC y ABC respectivamente. Vibrio cholerae O1 además se divide en dos biotipos: Clásico y El Tor, que difieren entre sí por pruebas de hemoaglutinación de eritrocitos de pollo, hemólisis de eritrocitos de carnero, sensibilidad a los bacteriófagos IV (Clásico) y (V) El Tor, la reacción de Voges–Proskauer (VP) y susceptibilidad a la polimixina B (3).

Los Vibrios que no aglutinan con el suero anti O1 se denominan genéricamente como no-O1 o no aglutinables (NAG). En 1994 el esquema de tipificación por serología reconocía hasta el serogrupo O140, en estos se incluían dos particularmente importantes, O139 (“Bengal”), causante de una epidemia parecida al cólera en el sureste asiático a finales de 1992 y el serogrupo O140 ó “Hakata”, el cual posee solamente el factor antigénico C (presente en serotipo Inaba), pero carece del factor A, el cual es específico para el Vibrio cholerae O1, el esquema actual incluye aproximadamente 200 diferentes variedades antigénicas (13).

La diseminación de la enfermedad en India y Bangladesh causada por el serotipo O139 o “Bengal”, marcó por primera vez que una cepa de Vibrio cholerae no-O1 haya sido asociada a grandes epidemias (14), aunque continúa estando confinada al Sur-Este Asiático. Vibrio cholerae O139 es responsable de aproximadamente el 15% de los casos de cólera confirmados en uno de los países endémicos de Asia (15, 16).

 

6. Vibrio cholerae bacteria adaptada para sobrevivir en hábitats distintos

El comportamiento epidémico de V. cholera, en su estadio de patógeno del humano, se ha asociado con los florecimientos de plancton, componente biótico del ambiente acuático que le permite mantenerse y reproducirse. Durante su estancia en su habitat primario, la bacteria presentan gran capacidad para responder a cambios ambientales como la temperatura y salinidad, variaciones cualitativas y cuantitativas de nutrimentos, presencia de depredadores y/o competidores, así como de la existencia de tóxicos tanto antropogénicos como biogénicos. La propiedad que ha desarrollado el género Vibrio para detectar y responder ante situaciones emergentes es de gran importancia para su supervivencia y transmisión. Diferentes estudios han conducido a la identificación de algunos mecanismos con los cuales la bacteria puede sobrevivir en situaciones extremas (17,18).

 

Cambios morfológicos ante la disminución de nutrimentos

El proceso que adoptan las bacterias ante la falta de un sustrato generador de energía es denominado “latencia”. En este estado los vibrios cambian su morfología y adoptan una forma de coco, perdiendo casi el 90% de su volumen original. Pierden la integridad de las capas externa, peptidoglican, e interna, reteniendo solo algunos remanentes, por otro lado, comprimen el material nuclear centralizándolo en la célula y rodeándolo de un denso citoplasma. Se ha observado que estos cambios están asociados a tasas metabólicas bajas, así mismo se ha demostrado que son reversibles, recuperándose la bacteria cuando regresa a condiciones favorables (19).

 

Características externas de la bacteria y papel de un polisacárido extracelular

La alteración de las estructuras externas y la adhesión en esta etapa son de gran significado ecológico. Se ha citado la presencia de formaciones fibrilares y un incremento en adhesión e hidrofobicidad. En la respuesta a bajos niveles de nutrimentos se observó la presencia de un polisacárido extracelular amorfo, observándose que este material le confiere carácter rugoso a sus colonias, además de resistencia a cambios osmóticos y de estrés oxidativo. Las formas rugosas forman además una matriz denominada zooglea la cual promueve la agregación celular. Bajo esta situación los vibrios forman biopelículas en las cuales las bacterias pueden atrapar y adsorber nutrimentos y protegerse de los depredadores. Se ha observado en V. cholerae una preferencia para formar éstas biopeliculas sobre sustratos quitinosos, vainas mucilaginosas de las algas y copépodos. A través de la biopelícula las células están interconectas por medio de prolongaciones que constituyen un glicocalix que se extiende desde el sustrato hasta la parte externa de la biopelícula (20,21,22).

 

Latente y no cultivable

Es un estado en que las bacterias ante un estrés son metabólicamente activas pero no capaces de llevar a cabo división celular. Por el hecho de no poder cultivarlas en medios artificiales a tal estado se le ha denominado viable no cultivable (VBNC). Se ha propuesto que esta etapa de la bacteria da lugar a su aparición cíclica, por lo que las bacterias desaparecen en ciertas épocas del año mientras que en otros aparecen. Esta condición se ha visto asociada a una reducción de nutrimentos, elevada salinidad o disminución de la temperatura (19,23).

 

7. V. cholerae, bacteria con dos cromosomas y diferentes estilos de vida

Diversos estudios señalan como algunos miembros del género Vibrio influyen de manera importante en diferentes ciclos biológicos del ambiente marino. Se ha encontrado que varias especies del mismo género son patógenos importantes para peces, moluscos y mamíferos. Con respecto a V. cholerae aún se tiene poca información sobre su ecología, la historia natural de la bacteria, incluyendo su presencia como organismo autóctono en áreas endémicas durante periodos libres de cólera, la existencia de ésta en periodos inter-epidémicos, los factores ambientales que contribuyeron a su re-emergencia en América Latina (24), así como a los componentes ambientales que contribuyen a su permanencia en regiones endémicas de cólera.

En años recientes se encontró que el genoma de V. cholerae y otros integrantes del mismo género, presenta 4,033460 pares de bases (pb), éste esta constituido por dos cromosomas circulares (25) de 2,961146 pb (cromosoma 1) y 1,072314 pb (cromosoma 2). En conjunto ambos codifican para 3,885 marcos de lectura abierta. La mayoría de los genes que son esenciales para las funciones básicas de la bacteria (replicación, transcripción y traducción del ADN y biosíntesis de la pared celular), así como de patogenicidad (toxinas y adhesinas), se localizan en el cromosoma mayor. Por otro lado, el cromosoma pequeño contiene 59% de genes hipotéticos, mientras que en el mayor el 42% de estos no tiene una función conocida. La mayoría de los genes requeridos para el crecimiento y viabilidad de la bacteria están ubicados en el cromosoma 1 aunque también, y solo presentes en el cromosoma 2, hay genes que pueden ser esenciales para el funcionamiento normal de la célula (dsdA, thrS, genes que codifican para las proteínas ribosomales L20 y L35 y otros que codifican para diferentes intermediarios de rutas metabólicas).

La secuencia del genoma de V. cholerae permitió confirmar la presencia de un sistema de captura de genes (isla de integración) localizado en el cromosoma 2 (125.3 kbp). Entre los genes presentes en esta isla se encuentran tres que codifican para productos involucrados en la resistencia a los antimicrobianos (cloramfenicol, acetiltransferasa, proteina para resistencia a la fosfomiocina y la glutation transferasa), varias enzimas del metabolismo del ADN (MutT, transposasa y una integrasa), genes de virulencia (hemaglutininas y lipoproteinas) así como tres genes que codifican para productos similares a las proteínas de `adicción del hospedero” (higA, higB y doc), los cuales son utilizados por los plásmidos para selección y mantenimiento en las células del hospedero.

El análisis de la secuencia del genoma de V. cholerae mostró que la mayoría de los genes presentaban gran similitud con los de E. coli (1,454 MLA (Marcos de lectura abierta)). También se encontró que 499 (12.8%) de los MLA tenían alta similitud con otros genes, lo cual sugiere la existencia de duplicaciones recientes. La mayoría de los MLA duplicados codifican para productos involucrados en funciones de regulación, quimiotaxis, transportes y adherencia, transposición y patogenicidad. De un total de aproximadamente 105 duplicaciones, por lo menos un MLA se encuentra en cada cromosoma lo que sugiere que se han presentado entrecruzamientos recientes entre ambos cromosomas. La extensa duplicación de genes involucrados principalmente en mantener la homeostasis de la bacteria (quimiotaxis y transporte de solutos), apoya la importancia de los productos de estos genes en la biología de V. cholerae, principalmente en relación a su capacidad para habitar diversos ambientes. Es probable que dichos ambientes en los que habita la bacteria, condujeron la duplicación y divergencia de los genes que son utilizados para funciones específicas. Al respecto se considera que los genes de virulencia están sujetos a presión selectiva, lo cual afecta el número de copias y su localización sobre el cromosoma. La existencia de varios MLA con funciones aparentemente idénticas en ambos cromosomas, sugiere la participación de transferencia lateral de genes y eventos de transposición (26).

La estructura de dos cromosomas se ha encontrado en otras especies del género Vibrio, este hecho sugiere que el contenido de genes del megaplásmido confiere a la bacteria una ventaja evolutiva, principalmente dentro del ecosistema acuático en donde las diferentes especies de Vibrio son los microorganismos dominantes. El porque el cromosoma 2 no se ha integrado en el cromosoma mayor no esta claro, se sugiere que tiene funciones especializadas importantes para la presión selectiva en la evolución. Una de ellas podría ser el haber acumulado genes que son mejor expresados a un alto o bajo número de copias que los ubicados sobre el cromosoma 1. Otra posibilidad es que en respuesta a alteraciones del ambiente solo uno de los cromosomas se transfiera a las células hijas (segregación aberrante). Aunque estas células con un solo cromosoma pueden ser defectuosas para su replicación (células latentes) mantienen su actividad metabólica y por lo tanto pueden ser una fuente potencial de las formas viables pero no cultivables (VBNC) descritas en V. cholerae (23) y otras bacterias. Las bacterias en estado de latencia también pueden jugar un papel en la formación de biocapas (biofilms) produciendo quitinasa extracelular, proteasas y otras enzimas degradantes que favorecen la supervivencia de la bacteria en la biocapa (22).

 

8. Transporte y metabolismo energético.

V. cholerae puede vivir en diversos hábitats, incluyendo su asociación con zooplancton, puede adquirir la forma planctónica en la columna de agua, así como patógena en el tracto gastrointestinal del humano. Por lo que no es sorprendente que la bacteria posea un gran repertorio de proteínas con enorme especificidad de substratos, mismas que le permitan realizar diferentes funciones catabólicas que respondan eficientemente a los constantes cambios en los ecosistemas (27). Los genes que codifican para las enzimas que realizan el transporte y/o degradación de diferentes substratos se localizan en ambos cromosomas (ribosa y lactato en el cromosoma 2 y trealosa en el 1). Sin embargo, muchas otras funciones metabólicas se realizan por genes de ambos cromosomas (glicólisis).

En el ambiente acuático, la quitina representa una fuente de carbono y nitrógeno. Esta fuente de energía es importante para V. Cholerae cuando esta asociado con el zooplancton, el cual tiene un exoesqueleto quitinoso (27,28). Para el transporte de molibdeno, fosfato y sulfato existen genes en uno o ambos cromosomas. Los involucrados en el transporte del molibdeno se localizan en el cromosoma pequeño, y los encargados del transporte del sulfato se encuentran en el cromosoma mayor. Sin embargo, en ambos cromosomas existen copias de los genes para los transportadores del fosfato, los cuales son diferentes en cada cromosoma indicando que no son consecuencia de una duplicación reciente.

 

9. Regulación intercromosomal

Las vías de regulación activadas en respuesta a señales ambientales y patogénicas se codifican entre los dos cromosomas. Lo anterior incluye procesos para la supervivencia durante periodos de inanición, censo por mayoría (quórum sensing) y expresión de la hemolisina (HlyA). En los periodos de carencia de nutrimentos, V. cholerae y otras bacterias Gram-negativas entran inicialmente en una fase estacionaria y posteriormente al estado VBNC. El factor sigma j38 (rpoS) es importante para la supervivencia de V. cholerae pero no para su patogenicidad, sugiriendo que dicho factor tiene una función muy importante en la iniciación del estado VBNC. Existe una copia de rpoS, localizada en el cromosoma 1, cerca de oriC RpoS que regula la expresión de proteínas como la catalasa, ciclopropano-graso-acil-fosfolípido sintetasa y HA/proteasa, las cuales se encuentran en ambos cromosomas. Los genes implicados en ‘quorum sensing’, regulación dependiente de la densidad celular, se encuentran también sobre ambos cromosomas. El conocimiento de la secuencia del genóma de V. cholerae está permitiendo entender, de manera más clara, cómo una bacteria de vida libre emerge como patógeno de enormes consecuencias para el humano.

 

10. Genes implicados en la virulencia de V. cholerae

El proceso infeccioso causado por V. cholerae es bastante complejo e involucra un gran número de factores; este patógeno se ayuda de ellos para establecerse y colonizar el epitelio intestinal, para lo cual expresa varios factores de colonización así como varias potentes enterotoxinas. Los genes cuyos productos actúan como factores de virulencia se encuentran formando parte de agrupamientos ("clusters"). Anteriormente se creía que estos genes formaban parte del cromosoma bacteriano de las cepas toxigénicas, pero actualmente se sabe que estos son parte del genoma de fagos de tipo filamentoso (29,30).

 

11. Toxinas y factores de colonización de V. cholerae

Una vez que la bacteria se instala en el epitelio intestinal empieza a producir la toxina colérica o CT, la cual altera el transporte de iones ocasionando la diarrea de tipo secretor que caracteriza el cuadro clínico del cólera. Los genes que codifican CT (ctxA y ctxB) forman parte de un elemento genético denominado elemento genético CTX (31, 32), el cual consiste por lo menos de seis genes que integran la región del core (ctxA, ctxB, zot, ace, cep y orfU), los cuales están flanqueados por dos o más copias de una secuencia repetitiva (Figura 3).

Se han identificado en cepas de V. cholerae otras toxinas importantes, una de ellas llamada Zot (Zonula Ocludens Toxin) tiene actividad sobre las uniones estrechas, incrementando la permeabilidad de la mucosa intestinal. Otra más es la toxina Ace (Accesory cholera toxin), ésta es una potente toxina que ocasiona daño a nivel de membrana en la célula eucariota, originando desequilibrio iónico. Aunque CT es el principal factor de virulencia, su acción es incrementada por el producto de diferentes genes, entre los que se encuentran los agrupamientos o clusters TCP (toxin corregulated pilus) y ACF (accesory colonization factors), cuyos productos actúan como factores de colonización. Ambos clusters se encuentran formando parte de lo que anteriormente se reportó como la isla de patogenicidad (VPI) (31,33).

 

12. CTX?, características y función en la transferencia de genes de virulencia

En 1996 usando la cepa de V. cholerae O1 P27459 (modificada genéticamente por un marcador y renombrada SM44) se demostró que el elemento CTX constituye en realidad el genoma de un fago filamentoso (CTX?). El fago puede propagarse en cepas receptoras de V. cholerae, en las cuales el genoma de CTX? puede integrarse al cromosoma en sitios específicos, o bien mantenerse en forma de plásmidos . Este fago filamentoso es de ADN de cadena positiva y está compuesto por una región de 4.5 kb llamada central o core (elemento CTX) la cual esta formada por seis genes (29):

ctxA-ctxB: codifican para la subunidad A y B de la toxina de cólera respectivamente.
zot: codifica para la toxina zonula occludens.
cep: codifica para la llamada pilina codificada en el core.
ace: codifica para la enterotoxina accesoria del cólera.
orfU: codifica un producto de función desconocida.

 

Figura 3. Representación gráfica del fago CTX

 

La liberación de CTX?, al igual que en otros fagos filamentosos, puede inducirse con luz ultravioleta o con mitomicina C (34). Una característica observada en este fago es que pude insertarse a una secuencia de 18 pb denominada attRS (sitio de ligamiento), presente en el cromosoma de algunas cepas de V. cholerae, o bien no integrarse y comportarse como un plásmido.

La parte central (core) se encuentra flanqueada por una o más copias de la región llamada RS, esta es una secuencia de repetidos que se ha dividido en RS1 y RS2 de 2.7 y 2.4 kb respectivamente. Esta región codifica para un sistema de integración sitio específico, presentando por lo menos 4 MLA. Se ha observado duplicación en tándem del RS y en algunas de todo el elemento CTX. Kimsey y col. (35) encontraron que RS1 y RS2 presentan diferencias en sus secuencias, lo que conlleva a diferencias funcionales entre los profagos encontrados en las cepas Clásica y El Tor. En las cepas de V. cholerae O1 del biotipo Clásico hay una copia del profago CTX en cada uno de los dos cromosomas; mientras que en las cepas del biotipo El Tor el profago está arreglado en tándem en los dos cromosomas. En las cepas El Tor el genoma del fago a menudo se encuentra flanqueado por una copia adicional de RS1, ésta contiene genes adicionales a RS2 (34,35).

 

13. VPI?, características y funciones

Para la introducción de CTX? en las cepas de V. cholerae es necesaria la presencia de TCP, que como ya se mencionó es un componente necesario para la colonización intestinal. Recientemente se ha propuesto que TCP también es codificado por un fago filamentoso denominado VPI? (30). El fago filamentoso VPI? codifica para TCP (Figura 4), el cual es un importante factor de virulencia así como receptor del fago CTX?. Al igual que CTX?, VPI? posee DNA de cadena sencilla y positiva, el genoma de este fago contiene los clusters TCP y ACF, los cuales contienen genes cuyos productos actúan como importantes factores de virulencia.

En ensayos realizados con anticuerpos anti-TCP se encontró que ésta es la principal proteína de cubierta del fago VPI?). VPI?, al igual que CTX?, reconoce una secuencia de inserción (att). Otros genes que conforman el genoma del fago son:

tagA: codifica para una lipoproteína.
aldA: al parecer codifica para una aldehido deshidrogenasa citoplásmica independiente de CoA, tagA y AldA forman parte del grupo de genes bajo la regulación de ToxR.
Int: codifica para una integrasa.
toxT: forma parte del regulon Tox.
xtn, tagD, y ssrA: son genes cuyos productos son desconocidos.

Figura 4. Representación esquemática del fago TCP

 

14. Regulación en la expresión de los factores de virulencia

El hábitat natural de las cepas toxigénicas de V. cholerae comprende diferentes ambientes, uno lo constituye el tracto digestivo del hospedero cuando la bacteria se comporta como patógeno; el otro es el ambiente acuático cuando actúa como microorganismo de vida libre. El microambiente del tracto intestinal provee las condiciones óptimas para la expresión de un gran número de factores asociados a virulencia. CT, TCP y por lo menos otros 17 genes involucrados en el proceso de virulencia están bajo el control de la cascada regulatoria ToxR-ToxT (36,37,38).

Al activarse ToxR sufre cambios conformacionales que dan como resultado la formación de dímeros que son estabilizados por la proteína ToxS que activa la transcripción de los genes ctxA y ctxB. ToxR además activa la transcripción del gen toxT, gen regulador que se encuentra en VPI y que es miembro de la familia AraC. La expresión de CT y TCP, así como de otros factores de virulencia, difieren entre las cepas de V. cholerae de los biotipos Clásico y El Tor, lo que ha sugerido la expresión diferencial del regulón ToxR en los dos biotipos debida a un control biotipo específico sobre la expresión de toxT (39). Los diferentes sistemas de regulación en V. cholerae conducen a una variación en la expresión de los genes de virulencia optimizando su permanencia en diferentes ambientes tales como el intestino humano y el hábitat marino.

 

15. Eventos involucrados en la generación de cepas epidémicas

Los mecanismos involucrados en la emergencia de nuevas clonas no han sido explicados, se considera que la combinación entre cambios genéticos y la selección natural causada por factores ambientales no identificados, así como el estado inmune de la población, influyen de manera importante en este proceso. Además de determinar la importancia de los factores ambientales dentro de la ecología de V. cholerae, se requiere conocer más con respecto a los mecanismos utilizados por los fagos filamentosos (CTX? y VPI?) en la transferencia de genes de virulencia. La existencia de epidemias ocasionadas por V. cholerae O139, de brotes debidos a cepas O37, así como el hallazgo de los genes ctxA, tcpA and toxR en cepas no O1 ambientales, apoya la hipótesis de que la transferencia horizontal de CTX? puede presentarse entre cepas O1 ctxA¯ tcpA+ o ctxA+ tcpA¯ y no-O1 ctxA+ or tcpA+, las cuales coexisten en el ambiente acuático (40,41,42).

Se ha mencionado que la infección de V. cholerae por CTX?, requiere la presencia de TCP, por lo que se propuso un sistema secuencial de dos pasos para la evolución de cepas epidémicas. Lo anterior sugiere que las bacterias inicialmente tienen que adquirir TCP a través de la infección por VPI?, para posteriormente ser infectadas por CTX?. Se sabe que los cultivos de V. cholerae que contienen al fago en cualquiera de sus formas (lisógenos o plásmidos) producen altos títulos del fago en sus sobrenadantes, por lo que la propagación del CTX? puede estar asociada con eventos de transferencia horizontal dando lugar a nuevas cepas toxigénicas (42).

Estudios en nuestro laboratorio (datos no publicados) permitieron observar como el sobrenadante del cultivo de la cepa epidémica O37 ctxAB+ tcpA+ toxR+ (aislada en Sudan en 1969) expuesto a la luz solar durante varios minutos liberaba partículas de CTX?. Por otro lado, al incubar una cepa O1 El Tor (2740-80) ctxAB¯ tcpA+ att+ con estos sobrenadantes, se encontró que se recuperaban lisógenos 2740-80 ctx+. Estos resultados sugieren que cepas de V. cholerae no-O1 ctxA+, pueden naturalmente ser inducidas para liberar viriones CTX? y de la misma manera lisogenizar cepas O1 no toxigénicas. Gracias a este tipo de mecanismos las propiedades de virulencia pueden evolucionar a grandes pasos a través de la transferencia horizontal de grandes bloques de material genético más que a la acumulación de mutaciones de nucleótidos. Estos eventos de transferencia horizontal de genes, probablemente se presentan en la naturaleza y es así como contribuyen de manera importante en el mantenimiento de las áreas endémicas de cólera.

 

16. Epidemiología

En enero de 1991, después de casi 100 años de no haber sido identificados brotes epidémicos de cólera en el continente americano (con excepción de la costa del Golfo de México en los Estados Unidos), se reportó la aparición de cólera epidémico en Perú relacionado con el aislamiento de una cepa de V. cholerae O1 biotipo El Tor serotipo Inaba (24). Al año siguiente, en 1992, se aisló una cepa causante de un brote de cólera en Madrás y en otras ciudades de la India, la bacteria no era del serogrupo O1 y fue clasificada como O139 (14). La aparición de un nuevo agente causal de un brote con características epidémicas planteó la enorme posibilidad del surgimiento de nuevas cepas epidémicas sugiriendo a su vez que el cólera no sólo se debía considerar como una enfermedad reemergente, sino también emergente. Estos hallazgos dieron lugar a un nuevo enfoque sobre las perspectivas para el estudio del cólera en el ámbito epidemiológico y molecular (15,16).

 

Epidemiología molecular del cólera

El conocimiento en la epidemiología del cólera tuvo un gran avance debido a las medidas de control de la enfermedad y a los adelantos en la biología molecular. Los estudios epidemiológicos de vigilancia y de tipificación molecular de Vibrio cholerae han permitido a su vez conocer mejor la evolución, diseminación geográfica y perspectivas globales de la enfermedad.

En 1978 se presentó un primer brote de cólera a lo largo de la costa del Golfo de México en los Estados Unidos, a este han seguido otros pequeños brotes de la enfermedad observados hasta fechas recientes (43). Mediante técnicas de southern blot e hibridación, con sondas para la toxina colérica, se demostró que los aislados de Vibrio cholerae O1 El Tor, obtenidos en dicha área, eran clonales y diferentes de los vibrios aislados durante la séptima pandemia. Una situación similar se observó en Australia al analizar cepas de Vibrio cholerae O1 aisladas de pacientes y del medio ambiente. En 1991, cuando el cólera llegó a Latino América, se utilizaron diferentes técnicas de biología molecular así como el método de enzimas multilocus (MLEE) para caracterizar las cepas causantes de la epidemia y definir la relación genética entre éstas y las responsables de la séptima pandemia obtenidas en diferentes partes del mundo. Los resultados obtenidos mostraron que los aislados de América Latina eran esencialmente clonales y probablemente una variante de las pertenecientes a la séptima pandemia, pero diferentes a las cepas de los brotes descritos en los Estados Unidos, a las aisladas en Australia y a cepas O1 no toxigénicas identificadas en los años 80 en diferentes países de América Latina (24).

Un estudio realizado por Evins y cols (44), con una colección de cepas Vibrio cholerae O1 no toxigénicas, O1 toxigénicas (aisladas desde el inicio de la epidemia en 1991) y variantes toxigénicas del hemisferio occidental, mostró que por lo menos hubo dos cepas responsables del cólera en América Latina. El origen de la cepa que ocasionó el nuevo brote de cólera en América es un misterio rodeado de especulaciones. Se ha propuesto que el microorganismo fue importado por viajeros procedentes de áreas donde el cólera es endémico, pero por otro lado también se sugiere que la bacteria era un microorganismo de vida libre nativo de las costas de Perú, el cual emergió por efecto de algún factor ambiental como un patógeno infeccioso con alto potencial epidémico.

En contraste con lo reportado anteriormente sobre las cepas de Vibrio cholerae O1, las cepas de Vibrio cholerae no-O1 no presentaban importancia médica o epidemiológica ya que se creía que solo eran responsables de casos esporádicos de diarrea en humanos. En octubre de 1992 un importante brote de una enfermedad parecida al cólera, causada por un serogrupo de Vibrio cholerae no-O1, apareció en India y Bangladesh y rápidamente se diseminó a Pakistán, Nepal, Tailandia, Malasia y China (14, 15). Estudios serológicos identificaron a estas cepas con el serogrupo O139 con el sinónimo “Bengal” (lo que indicó el lugar de aislamiento de las primeras cepas, las ciudades costeras de la bahía de Bengala). Estas cepas producían cantidades similares de toxina colérica a las observadas con V. cholerae O1, por otro lado también hibridizaban con sondas específicas para los genes ctxA y ctxB y las características clínicas de la enfermedad causada por estas eran indistinguibles del cólera (16,45,46). Ensayos con el método de enzimas multilocus demostraron que diferentes cepas de V. cholerae O139 aisladas en el Sureste Asiático mostraban un perfil electroforético idéntico al del Vibrio cholerae O1 Ogawa biotipo El Tor aislado en México durante la epidemia (47).

Resultados similares se obtuvieron al analizar cepas representativas del serogrupo O139, aisladas en diferentes lugares del mundo desde su aparición en 1992, y compararlas con las de una colección de V. cholerae O1, no-O1 y no-O139, aisladas entre 1969 y 1999. Lo anterior permitió sugerir que V. cholerae O139 incluye cepas epidémicas y no epidémicas que evolucionaron de diferentes linajes y derivan de V.cholerae O1 o no-O1 respectivamente. El análisis de 397 aislados de V. cholerae O1, O139 y otros serogrupos no O1, mostró por un lado la diversidad genética de la bacteria y por otro la relación genética entre las clonas epidémicas O1 y O139 y serogrupos no O1, así como su estructura poblacional (48).

Los resultados mostraron además que las cepas O1 y O139, pandémicas junto con una clona del serogrupo O37 (que en la década de 1960 demostró tener potencial epidémico), conforman un grupo relacionado genéticamente, sugiriendo que estas clonas surgieron por modificación del linaje que ya era epidémico o muy relacionado genéticamente al de las clonas epidémicas. La inferencia, por lo menos en este grupo de cepas, es que la tasa de transferencia horizontal y/o eventos de recombinación de genes del metabolismo básico son suficientemente altas para prevenir el desarrollo y el mantenimiento a largo plazo de alelos distintivos. Aún así los linajes clonales que se observaron pueden persistir por periodos largos de tiempo (hasta décadas), los ejemplos más obvios son las clonas epidémicas y pandémicas O1 y O139, pero más aún, el análisis identificó numerosas clonas y linajes clonales de cepas de V. cholerae no O1 con una extensa, distribución geográfica.

En estudios previos se demostró la existencia de recombinación de genes en la región rfb de V. Cholera, hecho que sugiere la emergencia de nuevos serogrupos con potencial epidémico. En un estudio realizado en México utilizando el método de enzimas multilocus para determinar el origen clonal de las cepas estudiadas (48), mostró que las cepas con un mismo serogrupo frecuentemente son divergentes y genéticamente distantes, lo cual apoya la evidencia anterior de que los genes rfb están sujetos a una alta frecuencia de recombinación. Estos resultados y el que los genes que codifican para los principales factores de virulencia se pueden adquirir por transferencia horizontal apoyan la propuesta de que cualquier V. cholerae se puede transformar en una cepa virulenta y epidémica. Aunque el conocimiento que se tiene sobre los integrantes del genero Vibrio se ha incrementado ampliamente en los últimos años, aún existen muchas interrogantes para poder controlar y erradicar su participación como patógenos del hombre.

 

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Última Actualización: 15/11/2007